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分子杂交技术的核酸探针标记法

发布日期:2019-07-17 21:08   来源:未知   阅读:

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  核酸探针根据核酸的性质,可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 分子生物研究中,最常用的探针即为双链DNA探针,它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。

  1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时i DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从5→3的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。

  (4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

  2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是:(1)Klenow片段没有5→3外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

  (2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:

  (4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。

  (5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。

  [注意]1、引物与模板的比例应仔细调整,当引物高于模板时,反应产物比较短,但产物的累积较多;反之,则可获得较长片段的探针。

  2、模板DNA应是线性的,如为超螺旋DNA,则标记效率不足50%。 用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。

  1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针,反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。

  (2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟,在30分钟内,使小离心管降到37℃;

  (6)68℃加热10分钟,使Klenow片段失活。调整NaCl浓度,使之适宜于酶切。

  (7)加入20单位限制性内切酶(如EcoRⅠ, HindⅢ等)酶切1小时。

  2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。

  反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料:已提纯的RNA或mRNA

  (5) 酚/氯仿抽提后,用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解,因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后,灭菌备用。 现以Klenow片段标记3末端为例说明末端标记的方法。

  (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。

  1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记,利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。

  3、末端标记还有其他的一些方法,如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子,也可利用该酶进行交换反应标记5末端。 利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。

  (1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5分钟,迅速置冰溶中。

  (3)再加入20单位T4多核苷酸激酶,置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。

  此方法是在每个探针的5末端多加了一个磷酸,理论上,这会影响其与DNA的杂交。因此,建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。

  除了常见的同位素标记探针外,还有利用非同位素标记探针和杂交的方法,许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售,可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。 许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP,则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点,主要是: RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。

  噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。 用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。并且用来合成RNA的模板能转录多次,可获得比单链DNA更高产量的RNA。

  反应完毕后,用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。

  另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子,对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点,因为合成的探针是RNA,它对RNase特别敏感,应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase;另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA,它有可能带上质粒的序列而降低特异性。

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